活性定義：
用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內(nèi)，將10 nmol脫氧 核苷酸摻入到酸性不溶物質(zhì)所需的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。
質(zhì)量控制：
經(jīng)過多次柱純化，SDS-PAGE檢測其純度大于99%；經(jīng)檢測無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一個(gè)月，無明顯活性改變。
使用方法：
以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。
1. PCR反應(yīng)體系：
| 試 劑 | 50 μl體系 | 終濃度 |
| 10×Pfu PCR Buffer | 5 μl | 1× |
| dNTP Mix，10 mM each | 1 μl | 200 μM each |
| Forward Primer（10 μM） | 1-2 μl | 0.2-0.4 μM |
| Reverse Primer（10 μM） | 1-2 μl | 0.2-0.4 μM |
| Template DNA | <1 μg | <1 μg/reaction |
| Pfu DNA Polymerase, 2.5 U/ μl | 1 μl | |
| RNase-Free Water | up to 50 μl |
注意：
1）用Pfu酶擴(kuò)增時(shí)，引物的純度要求較高，引物長度大于18個(gè)堿基，引物濃度請以終濃度 0.2-0.4 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2）鎂離子濃度請以終濃度1.5-3 mM作為設(shè)定范圍的參考。本產(chǎn)品的10×Pfu PCR Buffer中已經(jīng)含有20 mM鎂離子，可根據(jù)不同的引物對和模板來調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2. PCR反應(yīng)條件
| 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 2min |
|
變性 退火 延伸 |
94℃ 55℃-65℃ 72℃ |
30S 30S 60S * |
| 終延伸 | 72℃ | 5min |
* 延伸時(shí)間可以根據(jù)產(chǎn)物大小調(diào)整，Pfu DNA Polymerase擴(kuò)增速度為1kb/min
注意：
1）Pfu酶的熱穩(wěn)定性比Taq酶好，對于GC含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃，對Pfu酶的活性無影響。
2）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低2℃，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
3）Pfu酶具有3′-5′外切酶活性，所以Pfu酶擴(kuò)增時(shí)延伸速度遠(yuǎn)比Taq酶低，延伸時(shí)間根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品的擴(kuò)增延伸速率為1 kb/1 min,根據(jù)目的片段大小可以適當(dāng)更改延伸時(shí)間。
4）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
5）本產(chǎn)品具有3′-5′外切核酸酶活性，PCR產(chǎn)物3’端不帶“A”,不能直接用于T/A克隆，如需進(jìn)行T/A克隆則需要在其末端添加“A”或用平末端載體進(jìn)行克隆。
3. 結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
