泛素小史
泛素小史
譯者注：此文是譯作，原文作者是日本科學(xué)家田中啟二。原文載于2004年土羊社出版的“ユビキチンがわかる“。轉(zhuǎn)載時(shí)請(qǐng)注明原文作者，譯者名jsj97，譯文原文載于。
作者簡(jiǎn)介：田中啟二，1976年從德島大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究科大學(xué)院博士課程中途退學(xué)，經(jīng)過(guò)德島大學(xué)酶研究所助手，酶科學(xué)研究中心助教授，從96年起東京都醫(yī)學(xué)院研究機(jī)構(gòu)東京都臨床醫(yī)學(xué)綜合研究所分子腫瘤學(xué)研究部門部長(zhǎng)，2002年至今任同研究所副所長(zhǎng)。
譯者前言：當(dāng)初引起我翻譯這篇文章的沖動(dòng)是因?yàn)樗麑懙煤芎?，使我有一種想好故事大家分享的想法。但凡是說(shuō)起容易，做起來(lái)難，各種專業(yè)名詞和本人并不高的日語(yǔ)水平，使得這片并不長(zhǎng)的文章的翻譯時(shí)間拖了又拖。盡管我盡了最大努力，我仍然無(wú)法確定內(nèi)容的權(quán)威性，大家最好僅僅當(dāng)做一個(gè)故事，而對(duì)細(xì)節(jié)的正確與否請(qǐng)放過(guò)。
1 泛素發(fā)現(xiàn)的前夜
現(xiàn)在回想泛素的發(fā)現(xiàn)，不能不提到兩個(gè)先驅(qū)性的研究。泛素的發(fā)現(xiàn)最早要回溯到半個(gè)世紀(jì)前，1953年，Simpson 利用當(dāng)時(shí)普及的放射性同位素進(jìn)行代謝實(shí)驗(yàn)，發(fā)表了“生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分解中需要代謝能量即需要ATP的加水分解”的論文。但是，這個(gè)劃時(shí)代的研究，在以后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，被人忽視了。在當(dāng)時(shí)熱力學(xué)的世界觀中，加水分解反應(yīng)是產(chǎn)能反應(yīng)，與需要能量的合成反應(yīng)不同，這個(gè)過(guò)程是不需要能量的。另一個(gè)先驅(qū)性的研究是Goldberg等的論文（1977），他們報(bào)道在試管內(nèi)再現(xiàn)Simpson所觀察到的現(xiàn)象。這篇論文喚醒了在圖書館底沉睡的Simpson的發(fā)現(xiàn)。Goldberg等報(bào)道網(wǎng)織紅細(xì)胞的提取液中加入ATP顯著促進(jìn)了蛋白質(zhì)的分解，也就是伴隨著蛋白分解有能量的消耗。這個(gè)發(fā)現(xiàn)中，選擇網(wǎng)織紅細(xì)胞是獨(dú)具慧眼的。Goldberg等注意到網(wǎng)織紅細(xì)胞向紅細(xì)胞最終分化時(shí)候，不再需要的核，細(xì)胞器，溶酶體等細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)快速分解，也就是在蛋白質(zhì)合成活躍的網(wǎng)織紅細(xì)胞中，其分解活性也非常高?？梢赃@么說(shuō)，這個(gè)選擇決定了一切。實(shí)際上，如果不是在網(wǎng)織紅細(xì)胞的提取液中加入ATP，離體進(jìn)行Simpson 的實(shí)驗(yàn)觀察，泛素的發(fā)現(xiàn)可能還要等上好多年。ATP依賴性的蛋白分解在在體情況的發(fā)現(xiàn)，暗示了其生化學(xué)的可能機(jī)制。
上面的研究和其他關(guān)于蛋白質(zhì)分解的不可思議現(xiàn)象開始吸引人們的目光。1960年代前期，發(fā)現(xiàn)了充滿了加水分解酶細(xì)胞器--溶酶體，因此其被認(rèn)為蛋白分解的主要器官。但是溶酶體的非選擇性破壞方式難以說(shuō)明在細(xì)胞器中壽命和表達(dá)水平千差萬(wàn)別的蛋白質(zhì)個(gè)體間的矛盾。不過(guò)在當(dāng)時(shí)，這只是少數(shù)意見并逐漸銷聲匿跡了。但在70年代，隨著溶酶體機(jī)能抑制劑的開發(fā)，經(jīng)過(guò)這些試劑處理過(guò)的細(xì)胞仍然有恒定的蛋白質(zhì)分解難以抑制，表明了存在與溶酶體不同的蛋白分解系統(tǒng)，基于這些觀察，當(dāng)時(shí)稱之為“非溶酶體的蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)”。沒過(guò)多久，這個(gè)“非溶酶體的蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)”與前面所提到的“ATP依賴性的蛋白分解系統(tǒng)”便合二為一了。
為了保持溶酶體和細(xì)胞器內(nèi)的酸性pH值，需要代謝能量，但這些能量是來(lái)自膜型的ATP泵（ATPase）的作用，與Goldberg等所觀察到的細(xì)胞質(zhì)的能量消耗的機(jī)制是完全不同的。實(shí)際上，像大腸桿菌這樣的不含細(xì)胞器的原核生物的蛋白質(zhì)分解也是需要代謝能量的，由此明確了ATP依賴性蛋白水解酶系和溶酶體系統(tǒng)是相互獨(dú)立存在的。接著，在大腸桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ATP依賴性的蛋白水解酶的Lon酶(共有絲氨酸蛋白水解酶和ATP泵酶結(jié)構(gòu)的多功能酶)。Goldberg等人從Lon酶的經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，堅(jiān)信真核細(xì)胞中也存在ATP依賴性的蛋白水解酶，而在當(dāng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)并建立了網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)的Goldberg團(tuán)隊(duì)對(duì)探明ATP依賴性機(jī)制也擁有絕對(duì)的信心，但在這場(chǎng)大戲中確有意想不到的劇情出現(xiàn)，將他們所預(yù)想奪取到的“探明在真核細(xì)胞中ATP依賴性的蛋白質(zhì)分解機(jī)制”的光榮全部奪走，打破Goldberg團(tuán)隊(duì)美夢(mèng)的就是巨星Hershko和Varshavsky.
2 從APF-1的認(rèn)定到泛素的發(fā)現(xiàn)
Hershko在60年代后期，在以倡導(dǎo)“誘導(dǎo)酶”而聞名的Tomkin研究室中報(bào)告了類固醇激素誘導(dǎo)的酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的半衰期顯著縮短，其分解代謝需要能量。1971年，他回到了祖國(guó)以色列，繼續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分解的研究，1977年受到使用網(wǎng)織紅細(xì)胞的Goldberg等人的“ATP依賴性的蛋白分解系統(tǒng)”等相關(guān)論文的啟發(fā)，同當(dāng)時(shí)是研究生的Ciechanover一同進(jìn)行探明其機(jī)制的工作。他們采用化學(xué)方法分離，純化網(wǎng)織紅細(xì)胞提取液中的階段性的相關(guān)因子。很快的，在1978年得到了通過(guò)DEAE-cellulose方法的“階段1”和采用吸附高濃度鹽析的“階段2”。 幸運(yùn)的是，這些操作只是通常的為了將紅血球內(nèi)大量的血紅蛋白除去的生化學(xué)解析方法。階段1和階段2單獨(dú)幾乎難以見到ATP的促進(jìn)效應(yīng)，但當(dāng)二者混合時(shí)，可以觀察到ATP的促進(jìn)效應(yīng)。這個(gè)結(jié)果，顯示了ATP依賴性的蛋白質(zhì)分解路徑是復(fù)合的，并以簡(jiǎn)報(bào)的形式刊載在BBRC(1978)上。他們將這篇小論文作為自己最值得自豪的業(yè)績(jī)，即便在現(xiàn)在的講演中，也常常提及。
此后不久，在階段1中成功提純ATP-dependent proteolysis factor(APF-1)。APF-1是熱穩(wěn)定性很好的小分子蛋白。當(dāng)時(shí)推想，APF-1是階段2內(nèi)存在的尚未認(rèn)定的蛋白水解酶的活化因子，采用I125標(biāo)記的APF-1以檢測(cè)其相互作用的分子。但結(jié)果出現(xiàn)了令人驚奇的現(xiàn)象，125I -APF-1是以高分子梯狀出現(xiàn)的，而且明確了這個(gè)修飾反應(yīng)在ATP加水分解反應(yīng)中是必要的?，F(xiàn)在這個(gè)現(xiàn)象作為聚泛素化的現(xiàn)象是很自然的事情，但在當(dāng)時(shí)不難想象他們驚訝的程度。與原來(lái)的預(yù)想不同，1980年，APF-1被認(rèn)為是底物蛋白質(zhì)與所消耗的能量共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物。
現(xiàn)在有必要介紹一下泛素的研究歷史，最初在1975年，Goldstein把它當(dāng)作胸腺激素的一種發(fā)現(xiàn)的，但不久就明確了其不過(guò)是標(biāo)本中混入的物質(zhì)，也就是說(shuō)，泛素是一種“被錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)的分子”。但是正是在這個(gè)研究，創(chuàng)造了“泛素”這個(gè)名字得以流傳史冊(cè)。Goldstein等人，為了強(qiáng)調(diào)這個(gè)物質(zhì)在所有的組織細(xì)胞中普遍存在，即其普遍性（ubiquity）,稱其為泛素（ubiquitin）。在1977年，Goldknopf和Busch在細(xì)胞周期的研究中認(rèn)定了在染色體的組蛋白2A中與其異肽鏈結(jié)合的分子為泛素。這篇“泛素與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合”文章為明確泛素修飾反應(yīng)機(jī)制帶來(lái)了光明。接著，在1980年，Hershko與其共同研究者一道證明了APF-1和泛素是同一物質(zhì)。再次驗(yàn)證了泛素的功能。
3 Hershko的泛素假說(shuō)
很快Hershko和Ciechanover提出了泛素在蛋白質(zhì)分解中所起的基本作用的假說(shuō)：泛素通過(guò)E1（活化酶）,E2（結(jié)合酶）,E3（連接酶）的多級(jí)反應(yīng)，與目標(biāo)蛋白共價(jià)結(jié)合，多數(shù)泛素分子枝狀連接，形成聚泛素鏈，而聚泛素鏈成為蛋白水解酶攻擊的標(biāo)記，被捕捉到的目標(biāo)蛋白被迅速的分解。這個(gè)“泛素假說(shuō)”后來(lái)得到廣泛的稱贊。這個(gè)假說(shuō)的要點(diǎn)在于代謝能量是泛素活化所必須的，從概念上講，ATP的消耗在了蛋白分解的信號(hào)形成上了。這個(gè)假說(shuō)，對(duì)于Goldberg等人所預(yù)想的ATP依賴性的蛋白水解酶的概念完全不同，這種對(duì)能量依賴性蛋白質(zhì)分解機(jī)制的解釋不亞于晴天驚雷。有必要說(shuō)明的是，這一系列的研究的是由生物化學(xué)方法所取得的，而和當(dāng)時(shí)蓬勃發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)并無(wú)關(guān)聯(lián)。
在Hershko和Ciechanover提出泛素假說(shuō)的最初5年間竟然沒有競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的出現(xiàn)，這在和平年代里是極為罕見的。當(dāng)然，這也與當(dāng)時(shí)大家都難以相信這種“當(dāng)時(shí)難以想象的現(xiàn)象”有關(guān)，對(duì)于他們的假說(shuō)的可信度人們總是投去懷疑的目光。這也是獨(dú)創(chuàng)性到達(dá)了超世的境界，高處不勝寒的典型例子。但這種獨(dú)創(chuàng)性過(guò)高的同時(shí)也常常帶了些不幸。由于其超出常識(shí)，Nature,Science等世界超一流的雜志也不相信他們的發(fā)現(xiàn)，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)拒絕刊登。
4 Varshavsky的遺傳學(xué)的研究
對(duì)于泛素系統(tǒng)離體作用的證明中，貢獻(xiàn)最大的是Varshavsky和他的共同研究者，其門生很多，（Finley, Jentsch, Hochstrasser 等），現(xiàn)在仍然作為這個(gè)世界的帶頭人活躍著。Varshavsky在1977年，從原蘇聯(lián)莫斯科染色體研究所移居到了美國(guó)波士頓的MIT（麻省理工）。當(dāng)時(shí)他主要在進(jìn)行染色體的研究，由于這個(gè)關(guān)系，他注意到了Goldknopf和Busch關(guān)于泛素修飾的報(bào)告，并且圍繞泛素化的組蛋白H2A的染色體相關(guān)機(jī)能進(jìn)行了研究。以這個(gè)為契機(jī)，1980年左右 ，Varshavsky開始使用出芽酵母的逆遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)泛素系統(tǒng)進(jìn)行研究。接著，將Hershko等在生化學(xué)所認(rèn)定的E1,E2,E3等酶群所對(duì)應(yīng)的酵母基因一個(gè)一個(gè)的分離出來(lái)。這些研究將明確了泛素鏈作為細(xì)胞體內(nèi)實(shí)際分解信號(hào)的機(jī)能，將“泛素假說(shuō)”的假說(shuō)在文字上去掉了。同時(shí)他們以一連串的遺傳學(xué)的研究取得了關(guān)于泛素系統(tǒng)相關(guān)的許多前瞻性的研究 成果。在當(dāng)時(shí)，這一連串在Nature, Science, Cell雜志上發(fā)表的論文，在5年間席卷蛋白質(zhì)分解的世界。考慮到他們的研究對(duì)后來(lái)人的影響，他們的工作是值得大加贊揚(yáng)的。
5 蛋白質(zhì)水解酶體的發(fā)現(xiàn)
作為精彩的范例，“泛素假說(shuō)”從能量依賴性的蛋白質(zhì)分解機(jī)制的觀點(diǎn)來(lái)看，仍然有一個(gè)重大的缺陷，這就是泛素修飾只是ATP消耗的一個(gè)裝置而已。1983年，筆者和Goldberg通過(guò)證明泛素修飾后的蛋白質(zhì)分解仍然需要ATP的加水分解，因而主張“在蛋白質(zhì)分解的過(guò)程中ATP依賴性的2段學(xué)說(shuō)”。也就是說(shuō)，雖然已經(jīng)證明泛素以能量依賴性的信號(hào)附加機(jī)制，作為蛋白水解酶的攻擊標(biāo)識(shí)這個(gè)概念是正確的，但是實(shí)際上泛素修飾后的蛋白質(zhì)分解仍然需要能量。這個(gè)假說(shuō)的要點(diǎn)在于作為第二個(gè)ATP的消耗的分子機(jī)制，與原核生物一樣，真核生物也存在著同樣的ATP依賴性蛋白水解酶。這意味著在泛素登場(chǎng)前Goldberg的預(yù)測(cè)，一半是正確的。這個(gè)推斷帶來(lái)了稱為蛋白水解酶體的ATP 依賴性的蛋白水解酶的發(fā)現(xiàn)。蛋白水解酶體最早出現(xiàn)在科學(xué)雜志上是1988年，但搞明白它的分子結(jié)構(gòu)是在10多年以后?；ㄙM(fèi)如此長(zhǎng)的時(shí)間的理由在于這個(gè)酶體是一個(gè)分子量達(dá)到250萬(wàn)，總的亞基數(shù)達(dá)100個(gè)的生命科學(xué)史上最大最復(fù)雜的分子集合體。
蛋白質(zhì)水解酶體是和已知的蛋白水解酶從概念上完全不同的新奇酶體，它的發(fā)現(xiàn)路程，可以稱得上是一部電視連續(xù)劇。筆者作為這個(gè)酶體發(fā)現(xiàn)及其之后的研究進(jìn)展的當(dāng)事人之一，很遺憾將不能在這里講述“蛋白質(zhì)水解酶發(fā)現(xiàn)故事”，不過(guò)，有興趣的讀者可以去看看我的個(gè)人主頁(yè)（http://www.rinshoken.or.jp）。（譯者注：日文的）
6 泛素生物學(xué)研究的點(diǎn)火點(diǎn)
本文講述的不過(guò)是泛素發(fā)現(xiàn)的故事，對(duì)于其后泛素研究的進(jìn)展，是難以用一言兩語(yǔ)概括的。有關(guān)泛素依賴性蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)的生物學(xué)飛躍發(fā)展，而由這種突破所帶來(lái)的是發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的疾病和患者也是愈來(lái)愈多。本文只想記述有關(guān)其生物學(xué)發(fā)現(xiàn)前驅(qū)性研究的一個(gè)例子。1980年，在進(jìn)行細(xì)胞周期研究的一個(gè)日本團(tuán)隊(duì)（東京大學(xué)名譽(yù)教授山田正篤等）分離了可以誘導(dǎo)染色體異常凝固的溫度感受性的變異細(xì)胞ts85，并報(bào)告了在將這個(gè)細(xì)胞進(jìn)行非限制溫度下培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)修飾組蛋白H2A的泛素消失。當(dāng)時(shí)，對(duì)組蛋白泛素化研究的Varshavsky，注意到了這篇論文，獲得了ts85細(xì)胞，證實(shí)了ts85細(xì)胞存在泛素活化酶E1的變異，并使用這種細(xì)胞證明了泛素參與短壽命蛋白質(zhì)分解的。這篇1984年的報(bào)告是最初關(guān)于泛素系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)生理機(jī)能的里程碑式的論文。同時(shí)對(duì)ts85細(xì)胞研究也成為了研究泛素在控制細(xì)胞周期中重要性的重要手段。
1983年，Hunt發(fā)現(xiàn)了在細(xì)胞分裂期間周期性變動(dòng)的蛋白質(zhì)CyclinB, 接著在1991年，由Hershko團(tuán)隊(duì)和Kirschner各自獨(dú)立發(fā)表了CyclinB的周期性分解和泛素依賴性蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)相關(guān)的論文，細(xì)胞周期的研究從此掀開了新的一頁(yè)。接著，Hershko通過(guò)生化學(xué)的方法分離出CyclinB泛素化的E3連接酶，命名為cyclosome。這個(gè)多少有些夸大其詞的名稱來(lái)自能夠檢測(cè)到泛素化的CyclinB與其有20S的巨大分別。但是cyclosome最初也被投以懷疑的眼光。“所謂E3酶會(huì)不會(huì)是膜或是其他什么的尚未認(rèn)定的分子的結(jié)合的產(chǎn)物呢？”等等疑問不絕于耳。而在1996年，出現(xiàn)了將這些疑問完全打消的事件。世界上幾個(gè)不同的研究團(tuán)隊(duì)探明了cyclosome也稱為APC(anaphase-promoting complex)的分子結(jié)構(gòu)。其結(jié)果探明了APC是由10幾個(gè)亞體構(gòu)成的巨大分子復(fù)合體。現(xiàn)在成這個(gè)酶為APC/C。接著，京都大學(xué)的柳田充弘教授和Kim Nasmyth通過(guò)分離正在分離的染色體中異常誘導(dǎo)的酵母基因組，明確了APC/C構(gòu)成亞基和其多數(shù)情況下的靶分子。這是證明在細(xì)胞周期控制中，泛素依賴性的蛋白分解系統(tǒng)的重要性的決定性事件。這個(gè)結(jié)果揭開了ts85細(xì)胞在非允許溫度下染色體異常凝固的謎團(tuán)，也使得對(duì)細(xì)胞周期M期，也就是染色體分配的機(jī)制的研究到達(dá)了分子水平。在以后對(duì)細(xì)胞周期的研究中，泛素系統(tǒng)的重要性也變得愈來(lái)愈重要。特別是SCF和Mdm2等新泛素連接酶的發(fā)現(xiàn)，對(duì)它們的研究，證實(shí)了在細(xì)胞周期的順利進(jìn)行中，check point的調(diào)控中泛素依賴性的蛋白質(zhì)分解的中心作用。這些結(jié)果，確立了細(xì)胞周期是由蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)與泛素控制的蛋白水解控制的概念，這被稱為近年來(lái)癌研究的最大成果。
7其后對(duì)泛素研究的
距離1984年Finley, Ciechanover, Varshavsky 使用ｔｓ８５細(xì)胞，在Cell雜志上發(fā)表了“泛素與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解相關(guān)”的文章已經(jīng)20年了。2004年，Cell雜志為了紀(jì)念這個(gè)發(fā)現(xiàn)，刊登了當(dāng)事人的回憶文章。按照與這個(gè)發(fā)現(xiàn)有關(guān)的Pickart的回憶，1984年與泛素相關(guān)的文章不足100篇，2003年已經(jīng)超過(guò)了1000篇。這也從側(cè)面反映了泛素研究的飛速發(fā)展。而且在生命科學(xué)領(lǐng)域的頂級(jí)雜志Nature, Science, Cell中，每期都登載有“泛素話題”，現(xiàn)在關(guān)于泛素的研究仍然處于未見衰減的快速發(fā)展中。泛素—蛋白水解酶體作為決定體內(nèi)眾多生體反應(yīng)能夠快速，順序，一過(guò)性，單向進(jìn)行的合理手段，在細(xì)胞周期，凋亡，代謝調(diào)節(jié)，免疫應(yīng)答，信號(hào)傳遞，轉(zhuǎn)錄控制，質(zhì)量管理，應(yīng)激應(yīng)答，DNA修復(fù)等生命科學(xué)中眾多領(lǐng)域起到了中心的作用，已經(jīng)成為了難以動(dòng)搖的事實(shí)。
對(duì)泛素的研究也取得了意想不到成果。舉一個(gè)例子，最初提到的組蛋白的泛素化的研究中，也清楚了泛素也具有除了蛋白質(zhì)分解外的機(jī)能，例如，現(xiàn)在已經(jīng)探明，在胞飲，小泡運(yùn)輸?shù)鹊倪x擇，病毒的出芽等細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)流通系統(tǒng)，或是DNA修復(fù)，翻譯控制，信號(hào)傳遞中，泛素是起到了信號(hào)分子的作用。再舉一個(gè)例子，細(xì)胞存在著許多類似泛素分子（即泛素樣蛋白質(zhì)），它們獨(dú)立形成了巨大的“蛋白質(zhì)的由蛋白質(zhì)進(jìn)行的對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾系統(tǒng)”。它們對(duì)通過(guò)基因信息的增幅基因的進(jìn)行控制，能夠發(fā)揮基因模體上沒有的功能。更令人驚訝的是，泛素相關(guān)聯(lián)的基因群，占基因總數(shù)的2-3%。泛素，真的是難以說(shuō)是一種普通的蛋白質(zhì)。
泛素的發(fā)現(xiàn)中做出貢獻(xiàn)的Hershko, Ciechanover, Varshavsky在2000年被授予Albert Lasker Award。在2001年，以“Regulation of cellular function by the ubiquitin-proteasome system”為題目的第34回諾貝爾會(huì)議在斯德哥爾摩召開。Hershko, Goldberg, Varshavsky等所發(fā)起的FASEB Summer Conference “Ubiquitin and Protein Degradation” 對(duì)泛素的研究進(jìn)展有重大貢獻(xiàn)。第一屆在1989年，以后隔年召開，2004年為第8屆。第一屆的時(shí)候，參加者主要是上面3位偉人與其弟子。不過(guò)是泛素研究者的小型聚會(huì)?，F(xiàn)在，這種情況已經(jīng)改變，參加者半數(shù)以上是筆者不認(rèn)識(shí)的年輕研究者。加之從2003年開始，由CSH symposium組織的“泛素之家”，今后，這兩個(gè)會(huì)議將交替每年舉行。而且關(guān)于蛋白水解酶將于2005年在Clermont-Ferrand(法國(guó))舉行第6屆Proteasome Workshop。這些定期的國(guó)際會(huì)議以外，Keystone Symposium和EMBO workshop還對(duì)泛素話題頻繁舉行不定期的會(huì)議。從這些情況來(lái)看，現(xiàn)在泛素的正處在蓬勃發(fā)展的時(shí)期。但令人遺憾的是，高潮之后的世界將是怎樣的，仍然是未知的。果真能夠給生命的理解帶來(lái)福音么，或是仍然徘徊在謎亂的深淵。對(duì)于筆者個(gè)人來(lái)說(shuō)，雖然并不指望過(guò)長(zhǎng)的壽命，但想在泛素的研究看見完結(jié)的曙光時(shí)告別這個(gè)世界。
諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的獲獎(jiǎng)及其影響
2000年Hershko, Ciechanover, Varshavsky獲得Albert Lasker 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。這個(gè)獎(jiǎng)被稱為其獲得者的一半將獲得諾貝爾獎(jiǎng)，從這個(gè)時(shí)候起，泛素開始被視為諾貝爾獎(jiǎng)的候選者。在第二年也就是2001年，以“Regulation of cellular function by the ubiquitin-proteasome system”為題目的第34回諾貝爾學(xué)會(huì)在斯德哥爾摩的Karolinska研究所召開，這次會(huì)議除了Hershko, Ciechanover, Varshavsky，Goldberg等人，還召集了細(xì)胞周期，免疫，神經(jīng)等關(guān)于這方面研究的專家。接著，就如大家所知道的那樣，2004年，Hershko, Ciechanover, Rose 等3人獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
對(duì)于這個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)的獲得，無(wú)論是當(dāng)事人還是相關(guān)領(lǐng)域的研究者都是既歡迎又驚訝的。因?yàn)榫谷?ldquo;沒有Varshavsky而是Rose”，“不是醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)而是化學(xué)獎(jiǎng)”。
Rose是使用ATP的酶反應(yīng)學(xué)的權(quán)威，在初期和Hershko, Ciechanover共同進(jìn)行研究，對(duì)泛素修飾反應(yīng)的機(jī)制的探明有重大的功績(jī)。其后，其在人才的培育上也有非凡的成就。在最初使用生化學(xué)手段主張泛素假說(shuō)，這3名學(xué)者有極大的功績(jī)。
我個(gè)人的看法，Varshavsky未能獲得諾貝爾獎(jiǎng)的確是非常令人遺憾的。如果沒有Varshavsky的杰出工作，現(xiàn)在對(duì)泛素的研究也難以擴(kuò)展到現(xiàn)在這個(gè)地步。而且，Varshavsky在Nature, Cell, Science等雜志上刊登關(guān)于泛素系統(tǒng)的論文有數(shù)十篇之多。與此相對(duì)的是，此次獲獎(jiǎng)的3人幾乎為0。大概這個(gè)所代表的意義是，現(xiàn)代的基因工學(xué)，分子生物學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)的快速發(fā)展，這種進(jìn)步的本身就應(yīng)該帶來(lái)人體基因解析的大幅進(jìn)步，而這回這3個(gè)人使用的以前生化學(xué)和酶學(xué)的基礎(chǔ)性的所謂低技術(shù)而有了這種新概念的發(fā)現(xiàn)，有特別重大的意義。 因此，授予諾貝爾獎(jiǎng)是對(duì)這種獨(dú)創(chuàng)發(fā)現(xiàn)的最初發(fā)現(xiàn)的表彰吧。諾貝爾委員會(huì)正是標(biāo)榜自己來(lái)表彰這種“最初的發(fā)現(xiàn)”的?，F(xiàn)代高度發(fā)展的生命科學(xué)量產(chǎn)了大量論文，而這回諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的授予也可以說(shuō)是為這種真正帶有獨(dú)創(chuàng)意味的發(fā)現(xiàn)所做得特別警示吧。
另外還有一件事，使這回得獎(jiǎng)后在nature刊登的軼事。Hershko在諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)?lì)C布的第二天，他原來(lái)計(jì)劃準(zhǔn)備和孫女一起去游泳，結(jié)果從由堂兄打來(lái)的電話得到了被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的消息（諾貝爾委員會(huì)是使用電報(bào)通知受獎(jiǎng)?wù)?，而在這之前廣播播發(fā)了短信，聽到了這個(gè)消息的堂兄通知了本人）。也就是，對(duì)獲得化學(xué)獎(jiǎng)是極其意外的。是的，近年來(lái)，泛素的研究在醫(yī)學(xué)，病態(tài)生理學(xué)等領(lǐng)域日漸擴(kuò)大，很多人認(rèn)為更應(yīng)該授予醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)，實(shí)際上卻是化學(xué)獎(jiǎng)。這個(gè)化學(xué)獎(jiǎng)，有必要把目光放在蛋白質(zhì)作為配體的獨(dú)特調(diào)節(jié)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)意義這一焦點(diǎn)問題，進(jìn)行正確地認(rèn)識(shí)。Hershko的智慧，Ciechanover卓越的技術(shù)和行動(dòng)力，Rose深刻的酶學(xué)素養(yǎng)，這3個(gè)個(gè)性和才能毫不相同的科學(xué)家共同努力的結(jié)果，建立了泛素作為蛋白質(zhì)分解信號(hào)的假說(shuō)。
泛素-蛋白酶體途徑研究進(jìn)展
摘要 泛素-蛋白酶體途徑是一種高效蛋白降解途徑，主要負(fù)責(zé)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白的選擇性降解。此途徑參與體內(nèi)許多重要的生理功能，包括細(xì)胞周期的調(diào)控、抗原遞呈、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等，許多疾病的發(fā)生都是由于這一途徑的異常引起的，本綜述主要對(duì)其組成、作用機(jī)制及其功能在當(dāng)前的研究進(jìn)展以及未來(lái)的研究方向作一介紹。
關(guān)鍵詞 泛素；蛋白酶體；蛋白降解
泛素-蛋白酶體途徑是上世紀(jì)80年代早期由Aaron Ciechanover等人發(fā)現(xiàn)的蛋白降解途徑。這個(gè)途徑主要作用是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，它能夠選擇性的降解蛋白質(zhì)，使細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的降解受到精確的調(diào)控。而通過(guò)這個(gè)途徑安全有效地進(jìn)行眾多重要蛋白質(zhì)的降解，對(duì)于維持細(xì)胞的許多重要生理功能（如細(xì)胞周期的調(diào)控、抗原遞呈、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等）有著極其重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的許多遺傳性和獲得性疾?。ㄈ缒[瘤、囊性纖維化）的發(fā)生都與此途徑功能失調(diào)有關(guān)。本綜述主要對(duì)這一途徑的組成、作用機(jī)制及其功能在當(dāng)前的研究進(jìn)展及方向作一介紹。
1. 泛素-蛋白酶體途徑的組成成分及作用機(jī)制
1.1 組成成分
泛素-蛋白酶體途徑由泛素、泛素活化酶、泛素偶聯(lián)酶、泛素-蛋白連接酶、26S蛋白酶體、泛素再循環(huán)酶組成。
⑴泛素(ubiquitin) ：是由76個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量約8.5kD, 高度保守，存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)。因其存在豐富而廣泛故被稱之為泛素或泛在素。它主要的作用是以多聚泛素鏈的形式與要降解的底物蛋白結(jié)合，從而標(biāo)記底物蛋白，以便于下一步降解蛋白。Muller[4]等人發(fā)現(xiàn)了類泛素蛋白SUMO，它們也標(biāo)記底物蛋白但并不促使其降解，而似乎是為了使其更加穩(wěn)定或其它功能，其具體機(jī)制正在研究之中。
⑵泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme,E1）：是由兩個(gè)亞基組成的二聚體，兩個(gè)亞基分子量各約為105kD。目前僅發(fā)現(xiàn)一種有功能的E1，其功能主要是在ATP的參與下激活泛素，以利于進(jìn)行下一步反應(yīng)。是催化泛素與蛋白結(jié)合所需要的第一個(gè)酶。
⑶泛素偶聯(lián)酶（ubiquitin-conjugating enzymes,E2s）：是催化泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第二個(gè)酶，E2s的功能是與E1傳遞過(guò)來(lái)的泛素相結(jié)合，發(fā)揮其載體功能，以利于進(jìn)行下一步反應(yīng)。目前已有30余種E2s被分離出來(lái)，多數(shù)E2s為小分子量蛋白質(zhì)，且均含有一個(gè)保守的核心結(jié)構(gòu)域，約14~16kD, 其內(nèi)含有與泛素結(jié)合所需的半胱氨酸殘基。
⑷泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligating enzymes,E3s)：是催化泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第三個(gè)酶，它的主要功能是負(fù)責(zé)選擇性識(shí)別蛋白底物，催化蛋白泛素化。目前發(fā)現(xiàn)的E3s有幾十個(gè)，由于新的E3s不斷被發(fā)現(xiàn)，可能E3s的數(shù)量比我們目前所知的要多得多。E3s結(jié)構(gòu)相差較大，但大多數(shù)E3s是含有環(huán)指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。8個(gè)半胱氨酸和組氨酸與兩個(gè)鋅離子相互作用構(gòu)成了這個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)。到目前為止已發(fā)現(xiàn)了5個(gè)不同的E3s家族：第一個(gè)是N-末端規(guī)則酶E3α，這類酶通常與N-末端具有某些堿性氨基酸殘基（如精氨酸、賴氨酸）或與N-末端具有大量的疏水氨基酸殘基（如苯丙氨酸、亮氨酸）的蛋白質(zhì)結(jié)合；第二個(gè)是HECT（homologous to E6-AP C-terminus）結(jié)構(gòu)域家族，E6-AP可以間接和腫瘤抑制因子p53結(jié)合，導(dǎo)致p53蛋白的泛素化。人類基因組至少可以編碼20個(gè)不同的HECT結(jié)構(gòu)域蛋白。 還有3種不同類型的高分子量多亞基復(fù)合體，分別叫做APC（anaphase promoting complex）,PULC (phosphoprotein-ubiquitin ligase complexes)和CBC(cullin elongin B/C)連接酶。它們與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的降解有關(guān)。蛋白底物只有本身具有識(shí)別信號(hào)才能被E3識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)了四種可能的識(shí)別信號(hào)。
⑸E4 在酵母菌中發(fā)現(xiàn)一種能與較短的泛素鏈結(jié)合促進(jìn)長(zhǎng)泛素鏈形成的蛋白，稱之為E4。
⑹26S蛋白酶體（26S proteasome）:是一個(gè)非常巨大的復(fù)合體，至少有50個(gè)亞基組成，約2000kD,它占細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的1%左右。26S蛋白酶體是由一個(gè)20S核心蛋白酶體和兩個(gè)19S調(diào)節(jié)復(fù)合體結(jié)合而成的。20S蛋白酶體是由兩個(gè)α環(huán)和兩個(gè)β環(huán)疊加在一起形成筒狀結(jié)構(gòu)，兩個(gè)β環(huán)在內(nèi)側(cè)，其內(nèi)含有催化位點(diǎn)，兩個(gè)α環(huán)在外側(cè)，位于β環(huán)兩側(cè)。每個(gè)環(huán)各由7個(gè)亞基組成，真核生物的α環(huán)和β環(huán)各由7個(gè)不同的亞基組成，20S蛋白酶體的基本結(jié)構(gòu)可表示為α1~7β1~7β1~7α1~7。20S蛋白酶體含有多種蛋白酶活性：①類糜蛋白酶活性：水解疏水性氨基酸后面的肽鍵；②類胰蛋白酶活性：水解堿性氨基酸后面的肽鍵；③谷氨酰水解酶活性：水解酸性氨基酸后面的肽鍵；④支鏈氨基酸肽酶活性；水解支鏈氨基酸后面的肽鍵；⑤中性氨基酸切割活性。研究表明各活性部位之間可以互相調(diào)節(jié)。多肽在20S蛋白酶體內(nèi)降解的限速步驟是其被類糜蛋白酶位點(diǎn)切割，這步產(chǎn)生的多肽碎片進(jìn)一步被其它的活性位點(diǎn)切割，如谷氨酰水解酶。兩個(gè)19S調(diào)節(jié)復(fù)合體位于20S蛋白酶體的兩端，19S復(fù)合體至少有18個(gè)不同的亞單位。19S復(fù)合體的功能是識(shí)別泛素化的底物蛋白、展開底物蛋白、打開α環(huán)外面的一個(gè)室口、把底物運(yùn)到20S蛋白酶體內(nèi)，整個(gè)過(guò)程需要消耗能量，而19S復(fù)合體含有6個(gè)不同的ATP酶亞單位。
⑺泛素再循環(huán)酶（ubiquitin recycling enzymes）：包括泛素C-未端水解酶（ubiquitin c-terminal hydrolases UCHs）、同工肽酶（isopeptidases）、去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）。這類酶的功能是①通過(guò)水解多聚泛素鏈和促進(jìn)泛素前體轉(zhuǎn)化成泛素維持游離泛素的濃度；②使錯(cuò)誤標(biāo)記的底物蛋白去泛素化；③使多聚泛素鏈從26S蛋白酶體上分離下來(lái)，以免影響對(duì)其它蛋白的識(shí)別；④調(diào)節(jié)泛素化蛋白的降解速度，在一些情況下甚至通過(guò)移除或縮短多聚泛素鏈來(lái)阻止泛素化蛋白的降解。
1.2 作用機(jī)制
泛素-蛋白酶體途徑對(duì)蛋白質(zhì)的降解可分成兩個(gè)連續(xù)的步驟：①多個(gè)泛素分子與底物蛋白結(jié)合，從而標(biāo)記底物蛋白；②標(biāo)記了的底物蛋白被26S蛋白酶體降解,釋放并重新利用泛素。而第一步泛素與底物蛋白的結(jié)合過(guò)程需要3個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)完成。首先，泛素的C-末端甘氨酸殘基在一個(gè)ATP的參與下與泛素激活酶（E1）的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵；然后，E1把激活的泛素傳遞給泛素偶聯(lián)酶（E2s）,泛素與一個(gè)E2s活化的半胱氨酸殘基仍以高能硫酯鍵結(jié)合；最后，在一個(gè)泛素-蛋白連接酶（E3s）的催化下，泛素的C-末端與蛋白底物的賴氨酸殘基以一個(gè)酰胺異構(gòu)肽腱連接，從而完成3步反應(yīng)。通過(guò)上述反應(yīng)得到的泛素化的蛋白底物中泛素不是單個(gè)分子，而至少要有4個(gè)泛素分子，通常是后1個(gè)泛素分子結(jié)合到前1個(gè)泛素分子的第48位賴氨酸殘基上，這樣形成的聚合物與蛋白底物連接成復(fù)合物，目前在酵母菌中還發(fā)現(xiàn)第4種酶，稱作E4，它可以有效的催化長(zhǎng)的多聚泛素鏈的形成。第二步底物蛋白的降解，首先是26S蛋白酶體的19S調(diào)節(jié)復(fù)合體識(shí)別、結(jié)合、展平泛素化的底物蛋白，然后由26S蛋白酶體的催化核心20S復(fù)合體最終將蛋白水解成含有3~22個(gè)氨基酸殘基的多肽，而多聚泛素鏈在泛素再循環(huán)酶的作用下分解成單個(gè)泛素分子后釋放出來(lái)并被重新利用，從而形成泛素-蛋白酶體途徑的循環(huán)。
2. 與泛素-蛋白酶體途徑有關(guān)的生理功能
泛素-蛋白酶體途徑對(duì)細(xì)胞蛋白的降解在機(jī)體的許多生理功能中都起了很重要的作用，如細(xì)胞周期的調(diào)控、抗原遞呈、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞對(duì)應(yīng)激和細(xì)胞外效應(yīng)劑的應(yīng)答、細(xì)胞表面受體和離子通道的調(diào)控、DNA的修復(fù)、生理節(jié)奏的調(diào)控、發(fā)育和分化、凋亡等等，目前還不斷有新的作用被發(fā)現(xiàn)。
2.1細(xì)胞周期的調(diào)控
細(xì)胞周期受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴的激酶（Cdks）活性的波動(dòng)所控制，而這類激酶的活性又受到一些正向調(diào)節(jié)亞單位、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的合成與降解及負(fù)向調(diào)節(jié)因子、Cdk抑制劑濃度的波動(dòng)所控制。目前發(fā)現(xiàn)的G1細(xì)胞周期蛋白、有絲分裂細(xì)胞周期蛋白、Cdk抑制劑p27Kip1及阻止同源染色體分離的蛋白Cut2的降解都與此途徑有關(guān)。
2.2 抗原提呈
抗原提呈細(xì)胞中內(nèi)源性抗原被蛋白酶體攝取并降解成多肽，該多肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，所形成的多肽-MHC-Ⅰ類分子復(fù)合物被高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，供CD8+T細(xì)胞的TCR識(shí)別，并使之激活。
2.3 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
轉(zhuǎn)錄因子如E2F-1,fos,myc,NF-κB都受這個(gè)途徑調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB主要調(diào)控多種炎癥和免疫基因表達(dá)，它在胞漿內(nèi)與其抑制蛋白IκB結(jié)合成三聚體呈非活性狀態(tài)，當(dāng)受刺激劑刺激后IκB首先被IκB磷酸化激酶磷酸化，然后被泛素-蛋白酶體途徑降解，從而使NF-κB活化進(jìn)入核內(nèi)與相應(yīng)的DNA位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)多基因的轉(zhuǎn)錄。
2.4 凋亡
最近研究表明泛素-蛋白酶體途徑在凋亡的調(diào)控中起著重要的作用，一些與凋亡有關(guān)的調(diào)節(jié)分子（如Bcl-2、Jun N末端激酶、熱休克蛋白、Myc53）是通過(guò)蛋白酶體降解的。在一些實(shí)驗(yàn)中此途徑是起促進(jìn)凋亡的作用，而另一些實(shí)驗(yàn)中卻起到相反的作用，目前對(duì)其在凋亡中的具體作用正在研究之中[14]。
3. 泛素-蛋白酶體途徑與臨床
由于泛素系統(tǒng)牽涉到機(jī)體許多生理功能，那么由于這個(gè)系統(tǒng)的功能失常即功能過(guò)強(qiáng)或功能喪失就可能引起許多的病理?yè)p害。
3.1 骨骼肌高代謝
在嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒癥、惡性腫瘤等多種病理?xiàng)l件下，骨骼肌蛋白質(zhì)會(huì)表現(xiàn)為高分解代謝，長(zhǎng)期的高分解代謝對(duì)機(jī)體十分不利，可以引起肌肉的萎縮和消耗，延遲病人康復(fù)，甚至危及病人的生命。而近年的研究表明泛素-蛋白酶體途徑在骨骼肌高代謝的發(fā)生中起著最主要的作用。E3α家族和E2s中的E214k的mRNA水平在此情況下的是上調(diào)的，說(shuō)明此二者都與骨骼肌高代謝關(guān)系密切，因?yàn)槲覀冞€不完全清楚其它E2s和E3s的mRNA在此情況下的表達(dá)水平及作用，目前還不能判斷二者在骨骼肌代謝中的地位。
3.2 腫瘤
在人乳頭狀瘤病毒引起的宮頸癌中，癌蛋白E6可以使腫瘤抑制因子p53通過(guò)此途徑快速降解，引起癌細(xì)胞內(nèi)p53含量很低，E6主要起促進(jìn)連接酶與底物蛋白結(jié)合的作用。在前列腺、乳腺、結(jié)直腸惡性腫瘤中細(xì)胞周期蛋白信賴的激酶抑制劑p27Kip1也處于較低的水平，而p27的迅速降解是由于它的同源E3，Skp2水平的增加。β-鏈蛋白在結(jié)直腸上皮分化中具有重要作用，此蛋白也經(jīng)泛素系統(tǒng)代謝，如大量沉積則導(dǎo)致靶基因持續(xù)激活，導(dǎo)致惡性變。
3.3 遺傳性疾病
囊性纖維化（CF）是一種常見的多系統(tǒng)紊亂的遺傳病，囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）是一種氯離子通道，由于其編碼基因突變導(dǎo)致CFTR僅能小部分運(yùn)達(dá)細(xì)胞膜，其余在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被泛素-蛋白酶體途徑降解而引起疾病[15]。另外還有較少見的遺傳性疾病如Angelman綜合征主要由于染色體片斷缺失而造成E6-AP連接酶異常所致，遺傳性高血壓Liddle綜合征是由于對(duì)氨氯吡咪敏感的上皮鈉通道(EnaC)β、γ亞基富含脯氨酸（PY）區(qū)域缺失所致，EnaC是通過(guò)連接酶與PY區(qū)域結(jié)合被泛素系統(tǒng)降解的，PY缺失導(dǎo)致EnaC穩(wěn)定性增高，引起水鈉潴留導(dǎo)致高血壓。
4. 研究展望
泛素-蛋白酶體途徑是我們所知的最精細(xì)的蛋白降解途徑，對(duì)這個(gè)途徑分子機(jī)制的深入研究將有助于我們對(duì)機(jī)體各種與之有關(guān)的生理功能和疾病的認(rèn)識(shí)。由于目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些疾病中的關(guān)鍵蛋白的代謝與泛素-蛋白酶體途徑有關(guān)，這導(dǎo)致了新的治療方法的出現(xiàn)即通過(guò)調(diào)控此途徑對(duì)疾病進(jìn)行治療。目前有些蛋白酶體抑制劑用于癌癥治療，并取得了一定的成效，但由于針對(duì)于蛋白酶體的抑制劑的特異性較差，在起治療作用的同時(shí)也打亂了機(jī)體正常的生理功能，引起較大的副作用，而E3s與蛋白底物的識(shí)別與結(jié)合是較特異的，阻斷特定的E3s對(duì)其蛋白的識(shí)別或結(jié)合就可以限制其底物蛋白的降解從而起到治療作用，因此通過(guò)這種方式實(shí)現(xiàn)治療作用的藥物也將有可能出現(xiàn)。